انتقال ژن اینترفرون گاما- اولئوسین به گیاه کلزا و بررسی گیاهان تراریخت

استراتژی های مختلفی برای افزایش بیان و تجمع پروتئین نوترکیب در گیاهان در نظر گرفته می شود. از مهمترین عوامل موثر بر افزایش میزان تولید پروتئین نوترکیب در گیاه، بیان آن در بافت مناسب و نیز افزایش پایداری و تجمع پروتئین با استفاده از عوامل هدف گیری کننده به جایگاههای مناسب در سلول است. بیان پروتئین نوترکیب در بذر، موجب تجمع پایدار آن در غلظت نسبتا بالا در حجم کوچک و فشرده می شود که برای استخراج و ذخیره سازی بسیار مناسب می باشد. از طرف دیگر شبکه آندوپلاسمی سلول بدلیل حضور پروتئینهای چپرونی مختلف و ایزومرازها موجب بسته بندی صحیح پروتئینها شده و پایداری و تجمع پروتئین نوترکیب به میزان قابل توجهی افزایش می یابد. استراتژی دیگر استفاده از ژن اولئوسین گیاهی به منظور هدف گیری پروتئین نوترکیب به اجسام روغنی بذر می باشد. اتصال ژن اولئوسین به ژن مورد نظر و استفاده از پیشبرنده اختصاصی بذر، موجب قرار گرفتن پروتئین نوترکیب در اجسام روغنی بذر می شود. که علاوه بر تولید زیاد پروتئین، استخراج راحت تر و ارزانتر آن را نیز به دنبال خواهد داشت. در این تحقیق از دو استراتژی مذکور برای بیان پروتئین اینترفرون گامای انسانی در بذر گیاه کلزا استفاده شد. برای این منظور 3 نوع سازه مختلف طراحی و ساخته شد: 1) سازه pbi121-ifnγ 1 شامل ژن infγ + پیشبرنده napin، 2) سازه pbi121-ifnγ 2 شامل توالی kdel + ژن infγ + توالی kozak +پیشبرنده napin، 3) سازه pbi121-ifnγ-oleosin شامل infγ + توالی برشی + ژن اولئوسین+ پیشبرنده napin. سازه ها ی مذکور در ناقل گیاهی pbi121کلون و تائید شدند. سپس این سازه ها با روش انجماد و ذوب به اگرباکتریوم سویه lba4404 معرفی و این باکتری برای تراریختی گیاه کلزا از طریق ریزنمونه های لپه ای مورد استفاده قرار گرفت. گزینش نوساقه های باززائی شده در محیط انتخابی حاوی آنتی بیوتیک (کانامایسین و سفاتوکسیم) انجام شد. حضور سازه pbi121-ifnγ 2 و pbi121-ifnγ-oleosinدر گیاهان تراریزش شده در سطح dna با استفاده از pcr تائید شد. بررسی در سطح پروتئین با استفاده از sds-page نشان دهنده بیان پروتئین infγ در برخی گیاهان تراریخت شده با سازه pbi121-ifnγ 2 بود. در گیاهان مذکور فعالیت پروتئین تولید شده با تستهای elisa و dot blot و western blot نیز تائید شد. در مورد سازه pbi121-ifnγ-oleosin، علاوه برتائید انتقال سازه در سطح dna ژنومی، بررسی بیان در سطح rna با rt-pcr نشانگر نسخه برداری ژن ترکیبی بود. نتایج حاصل نشان داد که با در نظر گرفتن پروسه های بعدی از جمله تخلیص و ارزیابی فعالیت بیولوژیکی پروتئین تولید شده، بذر گیاه کلزا می تواند بعنوان یک بیوراکتور مناسب جهت تولید پروتئین های نوترکیب مورد استفاده قرار گیرد.